Ученый Ричард Паркер и его жена погибают при крушении частного самолета.
Их сын Питер Паркер продолжает вести двойную жизнь Человека-паука. Предотвращая кражу плутония, он мимоходом спасает Макса Диллона, сотрудника OsCorp, который с этого момента зацикливается на дружбе с Пауком.
Питер помнит обещание, данное отцу Гвен, и разрывает с ней отношения ради ее же блага.
В город возвращается друг детства Питера - Гарри Озборн. Его отец, генеральный директор OsCorp, умирает от генетического заболевания, и Гарри становится во главе корпорации.
Макса кусают генетически модифицированные электрические угри, и он мутирует в живой генератор. Он проявляет свою силу и ревнует к популярности Паука. После разрушительной выходки на Таймс-Сквер его упекают в психлечебницу, где он объявляет себя Электро.
У Гарри проявляются симптомы генетического заболевания его отца. Он узнает, что вылечить его может кровь Человека-Паука. Он просит Питера попросить Паука дать ему немного крови, но Питер, зная то, чего не знает Гарри, сам отказывает Гарри в образе Паука.
Гарри отстраняют от руководства из-за его одержимости засекреченными проектами корпорации. Он заключает соглашение с Электро, и вместе они проникают в лабораторию OsCorp. Гарри вводит себе сыворотку, но вместо исцеления мутирует в Зеленого Гоблина.
Питер находит предсмертное видеобращение своего отца о разработках биологического оружия, которые вели в OsCorp.
В образе Паука он вступает в схватку с Электро и затем с Гарри, который узнал, кем является Человек-Паук. Стремясь отомстить Питеру, Гарри похищает Гвен. Во время схватки Питера и Гарри она падает с высокой башни и погибает.
Питер долго не может оправиться после смерти Гвен, навещает ее могилу и не хочет больше быть супергероем.
Гарри находит себе нового союзника - Густава Фирса. Вместе они разрабатывают план по использованию материалов, захваченных в лаборатории OsCorp, для совершения преступлений.
Питер переосмысливает свое призвание и вновь надевает костюм Человека-Паука.
