По окончании средней школы в Лос-Анджелесе Миллер перебралась в Нью-Йорк. Дебютировала на сцене в 1985 году в бродвейской постановке «Biloxi Blues» («Билокси блюз»). Вместе с ней в спектакле сыграл Мэтью Бродерик (Matthew Broderick). За роль в «Biloxi Blues» Пенелопа Энн Миллер стала лауреатом престижной театральной премии «Тони».
Впервые Пенелопа Энн Миллер появилась на экране в 1985 году с ролью Кины в сериале «Tales from the Darkside» («Сказки темной стороны»). В 1987 году актриса отметилась ролями сразу в пяти телевизионных сериалах, таких как «The Facts of Life» («Факты из жизни»), «Family Ties» («Семейные узы»), «The Popcorn Kid» («Малыш Попкорн»), «Miami Vice» («Полиция Майами: Отдел нравов») и «St. Elsewhere» («Сент-Элсвер»). В том же 1987 году Миллер впервые снялась в полнометражном фильме. Это была драма Рика Кинга «Hotshot» («Горячий выстрел»).
В 1988 году Пенелопа Энн Миллер исполнила Дэйзи в экранизации театральной постановки «Biloxi Blues» («Билокси блюз»). В том же году актриса приняла участие в приключенческой комедии Рэндала Клайзера «Big Top Pee-wee» («Коротышка – большая шишка») и боевике Гэри Синиза «Miles from Home» («Вдали от дома»). В 1989 году Пенелопа сыграла главную роль в боевике Джона Франкенхаймера «Dead Bang» («Смертельный выстрел»), а также исполнила одну из главных ролей в комедийном боевике Ричарда Бенджамина «Downtown» («Крутой район»).
В начале 90-х актриса отметилась участием в лентах «Awakenings» («Пробуждение»), «The Freshman» («Новичок»), «Kindergarten Cop» («Детсадовский полицейский»), «Other People's Money» («Чужие деньги»), «Gun in Betty Lou's Handbag» («Пистолет в сумочке Бетти Лу») и «Chaplin» («Чаплин»).
За роль в ленте 1994 года «Carlito's Way» («Путь Карлито») Пенелопа Энн Миллер получила номинацию на премию «Золотой Глобус».
Среди самых заметных фильмов 2000-х с участием Миллер стоит отметить следующие: «Deal» («Сделка»), «Along Came a Spider» («И пришел паук»), «Messengers» («Посланники») и «Blonde Ambition» («Блондинка с амбициями»). Также она приняла участие в сериалах «Desperate Housewives» («Отчаянные домохозяйки»), «CSI: NY» («CSI: Место преступления Нью-Йорк») и «A Nero Wolfe Mystery» («Тайны Ниро Вульфа»).
